固体发酵芽孢杆菌在微生物肥料中的存活期研究
微生物肥料总的发展趋势是多菌种联合、多功能复合和多物料混合。利用有益微生物、有机物质、无机营养元素生产复合生物肥料，已经成为当前肥料行业的热点。目前复合生物肥料产业化发展亟待解决的问题一是活性微生物在高渗透压环境中存活性，二是复合微生物肥料烘干环节的高温环境极易使微生物丧失活性，三是微生物是有生命活性的，随着产品保存时间的延长和保存环境的变化，产品中有效活菌数降低，导致产品货架期短，而相关标准对产品有效活菌数有严格规定。因此，突破上述问题是复合生物肥料产业化发展的关键所在。为此，作者就固体发酵和液体发酵生产的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在不同工艺和不同存放期内的微生物存活率变化作了对比研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
无机营养元素 ：尿素（N-46%）、硫酸铵(N-20.5%)、磷酸一铵(N-11%,P
2O
5-47%)、硫酸钾(K
2O-51%)等(市场采购 ) 。
有机物质 ：发酵鸡粪 N-P
20
5-K
20含量分别为2.04%，1.93%和 1.06％，有机质含量35.6% ，水分39.5% 。泥炭 N-P
20
5-K
20含量分别为0.54 ％，0.11％，0.25％,有机质含量56%，水分45.6%。
中向生物固体发酵枯草芽孢杆菌菌粉：有效活菌数5.38×10
10cfu/g。液体发酵枯草芽孢杆菌菌粉：有效活菌数6.25×10
10cfu/g。固体发酵地衣芽孢杆菌菌粉：有效活菌数6.68×10
10cfu/g。液体发酵地衣芽孢杆菌菌粉：有效活菌数7.05×10
10cfu/g。填充料和粘合剂选用膨润土等。
主要仪器和设备：回转式干燥炉、圆盘造粒机、链式破碎机、振动筛 、流动式冷却床 、回转鼓式混合机、超净工作台、生化培养箱、恒温水浴锅、电子天平及其他实验室常规器皿和药品等。
1.2试验方法
1.2.1 温度对菌株存活的影响试验
分别称取固体和液体发酵的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌粉10g加入100 mL无菌水（装有玻璃珠）的三角锥瓶中，静置20min，充分震荡均匀30mim,先吸取5 mL菌液10倍梯度稀释到合适浓度, 吸取0.1mL菌液平皿涂布培养作为对照组。再将菌液分别于沸水，90 ℃ ，80 ℃下水浴20 min , 然后各吸取5 mL菌液10倍梯度稀释后的菌液平皿涂布培养 ,与对照组比较 ,分别计算各试验组芽孢杆菌的存活率
1.2.2 高含量菌粉货架期试验
分别取固体和液体发酵的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌粉1000kg（25kg×40包），放置在托盘上，每个托盘放置1000kg样品，常温储存0、3、6、9、12个月，按GB20287-2006抽样和检测有效活菌数。
1.2.3微生物肥料（粉剂）在不同化肥浓度环境下微生物存活试验
产品配方：(1)25%复合微生物肥料（化肥含量46%）：发酵鸡粪53%、农用磷酸一铵9%、农用硫酸钾15%、尿素22%、稀释菌粉1%。主要技术指标：N-P
20
5-K
20分别为12.5-5.1-8.2，有机质（以干基计）24.5%，水分22.5%。（2）15%复合微生物肥料（化肥含量23.5%）：发酵鸡粪75.5%、农用磷酸一铵4%、农用硫酸钾8.5%、尿素11%、稀释菌粉1%。主要技术指标：N-P
20
5-K
20分别为7.0-3.2-5.1，有机质（以干基计）38.5%，水分29.5%。（3）生物有机肥（未添加化肥）：发酵鸡粪99%、稀释菌粉1%.主要技术指标：N-P
20
5-K
20分别为2.0-1.9-1.0，有机质（以干基计）59.5%，水分39.5%。（稀释菌粉制作方法为将5-7×10
10cfu/g高含量的芽孢杆菌发酵菌粉用膨润土按比例稀释到5×10
9cfu/g）。生产工艺：将各种原料按配方称量后用回转鼓式混合机混合均匀，定量每包40kg。产品添加菌粉分别为固体发酵枯草芽孢杆菌菌粉、固体发酵地衣芽孢杆菌菌粉、液体发酵枯草芽孢杆菌菌粉、液体发酵地衣芽孢杆菌菌粉四种，每种菌粉生产肥料产品1000kg（40kg×25包），放置在托盘上，每个托盘放置1000kg样品，常温储存3、6、9、12个月，按NY/T798-2015规定抽样和检测有效活菌数。
1.2.4复合微生物肥料（颗粒）微生物存活试验
产品配方：发酵鸡粪40%、泥炭5%、农用磷酸一铵8.5%、农用硫酸钾14%、尿素21.5%、膨润土10%、稀释菌粉1%。（稀释菌粉制作方法为将5-7×10
10cfu/g高含量的芽孢杆菌发酵菌粉用膨润土按比例稀释到5×10
9cfu/g）。生产工艺：将各种原料按配方称量后用回转鼓式混合机混合均匀，圆盘造粒机造粒，回转式干燥炉干燥（进口温度180℃， 出口温度80℃，烘干25min；），流动式冷却床冷却，定量定量每包40kg。主要技术指标：N-P
20
5-K
20分别为12.1-5.2-8.3，有机质（以干基计）21.2%，水分14.6%。产品添加菌粉分别为固体发酵枯草芽孢杆菌菌粉、固体发酵地衣芽孢杆菌菌粉、液体发酵枯草芽孢杆菌菌粉、液体发酵地衣芽孢杆菌菌粉四种，每种菌粉生产复合微生物肥料1000kg（40kg×25包），放置在托盘上，每个托盘放置1000kg样品，常温储存3、6、9、12个月，按NY/T798-2015规定抽样和检测有效活菌数。
2 结果与分析
2.1水浴温度对芽孢杆菌存活的影响
芽孢杆菌能产生抗逆性很强的内生孢子，与其他微生物相比，能更耐高温环境。通过高温水浴可以考察不同的种属的芽孢杆菌和同一种属不同工艺生产的芽孢杆菌产品耐高温的能力。
表1 水浴温度对芽孢杆菌存活的影响
不同水浴温度对芽孢杆菌存活影响的试验结果表明(表1)：80℃、90℃、100℃水浴温度下液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高14.7%， -57.4%和0%。80℃、90℃、100℃水浴温度下固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高-0.9%，2.1%和-19.7%。80℃、90℃、100℃水浴温度下固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高-1.5%，76.6%和8.5%。80℃、90℃、100℃水浴温度下固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高14.1%，27.1%和28.2%。不管是枯草芽孢杆菌还是地衣芽孢杆菌，在不同的水浴温度条件下，固体发酵产品存活率都高于液体发酵产品。
2.2常温储存时间对芽孢杆菌存活的影响
表2 不同时间常温储存对芽孢杆菌存活的影响
常规温度（湖北地区）大规模储存芽孢杆菌其存活率试验结果表明（表2）：储存3、6、9、12个月液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高2.8%，3.2%、6.3%和13.1%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高3.1%，5.4%、7.8%和12.3%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高4.3%，7.5%、10.3%和13.8%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高4.0%，5.3%、8.8和14.6%。这说明了枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌抗逆性更强，固体发酵产品比液体发酵产品更容易保存。
2.3化肥含量对芽孢杆菌存活的影响
芽孢杆菌在生物有肥料中存活试验表明（表3）：储存3、6、9、12个月液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高8.0%，8.3%、8.8%和12.9%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高8.2%，10.0%、9.5%和7.1%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高7.5%，6.8%、7.5%和7.1%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高7.3%，5.1%、7.0%和9.8%。枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌存活更高，固体发酵产品比液体发酵产品容易存活。
芽孢杆菌在15%复合生物肥料中存活试验表明（表4）：储存3、6、9、12个月液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高6.7%，9.8%、9.9%和10.2%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高1.7%，3.9%、8.3%和10.1%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢
表3 生物有机肥对芽孢杆菌存活的影响
杆菌分别高2.8%，4.8%、5.5%和7.9%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体酵地衣芽孢杆菌分别高7.8%，10.7%、7.1%和8.0%。枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌存活更高，固体发酵产品比液体发酵产品容易存活。
表4 15%复合生物肥对芽孢杆菌存活的影响
表5 25%复合生物肥对芽孢杆菌存活的影响
芽孢杆菌在25%复合生物肥料中存活试验表明（表5）：储存3、6、9、12个月液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高3.3%，6.0%、15.3%和15.6%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高5.2%，5.6%、11.2%和12.4%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高6.8%，6.4%、6.1%和5.9%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高4.9%，6.8%、10.3%和9.1%。枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌存活更高，固体发酵产品比液体发酵产品容易存活。
综合表3、表4、表5数据表明：生物有机肥（不添加化肥）、15%复合生物肥（化肥含量23.5%）、25%复合微生物肥料（化肥含量46%）储存12个月，液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高12.4%，7.2%、15.6%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高9.7%，10.1%和12.4%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高7.1%，6.9%、和5.9%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高9.8%，8.0%和9.1%。固体发酵的枯草芽孢杆菌在三种肥料中存活率最高，12个月存活率分别为84.4%、65.3%和44.8%。液体发酵的地衣芽孢杆菌在三种肥料中存活率最低，12个月存活率分别为64.9%、47.2%和23.3%。随着肥料中化肥含量增加芽孢杆菌有效活菌呈现下降趋势，盐浓度对微生物活性有一定的影响。枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌对高渗透压环境更适应。固体发酵菌粉更有利于芽孢杆菌存活。
2.4复合生物肥料造粒、烘干工艺对芽孢杆菌存活的影响
表6 25%复合生物肥料（颗粒）造粒、烘干工艺对芽孢杆菌存活的影响
芽孢杆菌在25%复合生物肥料(颗粒)中存活试验表明（表6）：烘干工艺（进口温度180℃，出口温度80℃，烘干25min；）对芽孢杆菌存活影响较大，经过高温烘干后，芽孢杆菌存活率为67.8%-42.1%，一半的芽孢杆菌死亡。烘干后液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌高11.5%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌高16.6%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌高14.2%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌高9.1%。储存3、6、9、12个月液体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高13.1%、13.0%、14.2%和14.7%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比固体发酵地衣芽孢杆菌分别高14.1%、12.4%、11.1%和10.1%。固体发酵枯草芽孢杆菌存活率比液体发酵枯草芽孢杆菌分别高11.7%，12.0%、11.2%和9.0%。固体发酵地衣芽孢杆菌存活率比液体发酵地衣芽孢杆菌分别高10.7%，13.6%、14.3%和13.6%。结果表明枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌、固体发酵产品比液体发酵更耐高温、高盐环境。
3 讨论
生物肥料中芽孢杆菌的稳定性取决于选择菌种的特性、生产工艺和使用方法。研究表明：枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌对环境的耐受能力强，这是由于两种微生物自身遗传特性决定的。不论是枯草芽孢杆菌还是地衣芽孢杆菌，固体发酵产品对环境的耐受能力高于液体发酵产品，原因有可能是固体发酵工艺接近芽孢杆菌生长的自然状态，芽孢杆菌的芽孢健壮，抗逆性更强。固体发酵产品烘干采用的是低温流化床工艺，液体发酵产品采用的高温喷雾干燥工艺，低温工艺对芽孢破坏更小，有利于芽孢抵抗不良环境。还有报道认为：固体发酵产生的芽孢有更厚的细胞壁和更少的细胞器、芽孢更小，芽孢具有更好的抗高温性，长时间储存后的芽孢发芽率也比液体发酵生产的高；固体发酵的芽孢细胞壁存在一种小分子的疏水蛋白。而液体发酵芽孢的疏水蛋白在发酵液可以检测到，而细胞壁中很少。固体发酵芽孢有较强的疏水性而抵抗高温；另外，固体发酵生产的芽孢聚集成团，也能减少热灭活效应。
生物有机肥、15%复合生物肥、25%复合生物肥、25%复合生物肥（颗粒）生产中采用固体发酵生产枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌12个内有效活菌数比液体发酵产品分别高8%和13.1%、10.6%和14.5%、13.2%和28.1%、20.7%和40.7%。这样在一定的有效期内满足产品符合国家标准和农业部标准对有效活菌数规定的前提下，采用固体发酵生产的芽孢杆菌可以减少菌剂投料量，降低生产成本。同时，在肥料大田应用中，有效活菌数含量相同的产品，固体发酵生产的芽孢杆菌活力更高，效果更强。故此，固体发酵芽孢杆菌在肥料生产中应用具有明显的优势。
